Nič o GFP-ju?

V Kavarni ob robu vesolja si lahko preberete, kako so odkrivali HIV in kakšno tekmovanje med Francozi in Američani je potekalo v ozadju. Tako so se morda Američani letos ob podelitvi Nobelove nagrade za medicino počutili opeharjene, a verjetno povsem neupravičeno. O virusih HIV in HPV se da veliko povedati, pa še vsak si ob tem kaj predstavlja. Kaj pa Nobelova nagrada za kemijo? Zgodba morda ni tako napeta, je pa vseeno zanimiva. Podelili so jo za odkritje, razlago delovanja in uporabo zelenega fluorescirajočega proteina (GFP), brez katerega si sodobnih raziskav v celični in molekularni biologiji ne moremo več predstavljati.

Začelo se je leta 1962, ko je Osamu Šimomura iz pacifiških meduz vrste Aequorea victoria izoliral protein, ki je ob vezavi kalcija oddajal modro svetlobo. Šimomura se je že prej ukvarjal s proteini, ki sodelujejo pri bioluminiscenci, a iz drugih organizmov. Da bi uspel izolirati dovolj proteina, je moral stisniti in precediti 'sok' iz tisočev in tisočev meduz. Protein, ki veže kalcij, je imenoval ekvorin in ugotovil, da bi ga bilo mogoče uporabiti kot senzor za koncentracijo kaclija v celici. Če bi v celice spravili ekvorin, bi ta oddajal modro svetlobo - več ko je kalcija, močnejša bo. Članek o tem je objavil v ugledni reviji Science leta 1963. Šele precej kasneje, sredi sedemdesetih let, so razložili, da modra svetloba ekvorina ni končni produkt bioluminiscenčnih reakcij, pač pa ta deluje na drug protein, zeleni fluorescirajoči protein, ki nato oddaja zeleno svetlobo. Šimomura je v več člankih poročal, kako je prišlo do odkritja ekvorina in kako obsežna predelava meduz je bila potrebna, da je s sodelavci lahko izoliral dovolj velike količine proteina za natančnejšo analizo. Vsak dan so morali predelati več kot 3000 meduz, ki so jih dobili od ribičev.
Na kratko je prispevek Šimomure k odkrivanju GFP-ja prikazan na spletni strani o zgodovini odkrivanja in uporabe tega proteina.

Drugi letošnji nagrajenec je Martin Chalfie, ki sploh ni raziskoval GFP-ja, pač pa genetiko valjastih črvov (Caenorhabditis elegans) in je o GFP-ju slišal na nekem seminarju leta 1988. Takoj si je zamislil, da bi GFP uporabil za testiranje promotorjev - močni promotorji (mesta za vezavo encima, ki DNA prepisuje v mRNA), povezani z zapisom za GFP, bi povzročili, da bi se črvi pod modro svetlobo zeleno svetlikali. Ker pa v tistem času sploh še ni bilo znano zaporedje nukleotidov v genu za GFP (te eksperimente je delal Douglas Prasher, ki si je za cilj zadal, da bi GFP povezal s hemoglobinom in s tem fluorescenčno označil hemoglobin v celici), je uspel pripraviti ključne konstrukte šele leta 1994.

Tretji dobitnik Nobelove nagrade za kemijo pa je Roger Tsien. Sredi osemdesetih se je ukvarjal s senzorji za kalcij, a se je šele po desetih letih ponovno vrnil k tej temi in razvil serijo fluorescirajočih molekul na osnovi GFP, ki fluorescirajo v drugih barvah in močneje kot izhodni GFP. Osnova za razvoj novih verzij je bilo razumevanje mehanizma fluorescence v GFP-ju (to je v osnovi razvozlal Šimomura leta 1979), poznavanje nukleotidnega zaporedja (Prasher, 1992) in prostorske zgradbe zelenega fluorescirajočega proteina (objavljeno 1996).

Zanimivo je, da je pri odkrivanju GFP sodelovala tudi Slovenka Katjuša Brejc, ki je v devetdesetih delala na Nizozemskem in je prva avtorica članka, v katerem so objavili mehanizem fotoizomerizacije med dvema oblikama GFP (1997).