24. maj 2010

Rojstvo Sintije

V četrtek (20.5.) so pri reviji Science kot pomembno predhodno objavo (spletni časopis Sciencexpress) izdali članek, v katerem avtorji z Inštituta J. Craiga Venterja poročajo o sintezi celotnega genoma bakterije Mycoplasma mycoides in njegovi uspešni vključitvi v celice Mycoplasma capricolum, v katerih je nadomestil naravni genom. Nedvomno gre za pomemben dosežek, čeprav mogoče manj pomemben kot to nekateri poskušajo prikazati.

S stališča biotehnologije je sinteza celotnega genoma nekega mikroba vsekakor veliko in drago delo. Avtorji ocenjujejo, da jih je stalo 40 milijonov USD, kar je nedvomno pretirano, saj so verjetno šteli vse posredne stroške, pa tudi stroške dela za preteklih 10 let, kolikor trdijo, da je raziskava potekala (kar je spet pretirano). Ista raziskovalna skupina je objavila članek o sintezi celotnega genoma že leta 2008, vendar je takrat šlo za bakterijo Mycoplasma genitalium, ki je skoraj pol manjši (580.000 bp) od tokrat sestavljenega kromosoma M. mycoides. S stališča sinteze genoma gre torej za večji zalogaj, tehnologija pa ni nova. Sama sinteza torej ne bi opravičevala velikih stroškov. Mimogrede, samo sinteza koščkov genov bi stala približno 350.000 EUR, k temu pa je treba prišteti še vedno zahtevno sestavljanje koščkov in preverjanje dobljenih zaporedij.

Zgolj sinteza genoma ima eno veliko pomanjkljivost: s tem genomom ni kaj početi. Leta 2008 je manjkal ključen del poskusa, ki bi pomenil pomembno nadgradnjo: dokaz, da genom res deluje, kot bi moral. Genom bi bilo treba vstaviti v celico in preveriti, ali se je sposoben podvojevati in ali res uspešno zapisuje za vse procese, ki so celici potrebni za življenje. Z genomom M. genitalis to očitno ni bilo mogoče in nihče ni mogel zagotovo reči, kaj je temu krivo. Nekateri so sumili, da je problem v metilacijskem (epigenetskem) vzorcu DNA, lahko pa bi bilo tudi kaj drugega. Rešitev problema so znanstveniki poiskali v svojih lastnih rezultatih iz leta 2007.

Tri leta nazaj so raziskovalci z Venterjevega inštituta izvedli poskus, v katerem so iz bakterij Mycoplasma mycoides izolirali kromosom in ga prenesli v bakterije M. capricolum. Šlo je torej za kromosom, izoliran iz naravnih celic, ki je v celicah bakterij druge vrste zaradi selekcijskega pritiska po več generacijah celic nadomestil stari genom. Govorimo o presaditvi genoma, podobno kot lahko jetra enega človeka presadijo drugemu človeku in tam delujejo tako kot so pri prvem. Vendar je pri tem velika razlika: pri presaditvi kromosoma prejemna celica (res da šele po številnih delitvah) izgubi svoje lastnosti in postane taka, kot je bila celica, iz katere so odvzeli DNA. Ker so torej imeli dokaz, da je prenos genoma M. mycoides v celice M. capricolum možen, so poskusili enak postopek izvesti s sinteznim genomom.

Ker je sintezni genom M. mycoides imel vključene nekatere gene, ki jih naravni nima (na primer gen za odpornost proti antibiotiku tetraciklinu in gen za encim betagalaktozidazo, ki omogoča, da celice brezbarvni substrat pretvorijo v modro obarvan produkt), so lahko v laboratoriju uporabili rastne pogoje, ki so omogočili rast samo tistih celic, ki so sprejele sintezni genom. Postopek je zelo nizko učinkovit, a je bil uspešen.

Ob omenjenih 'velikih poskusih' so morali izvesti še nekatere, ki se zdijo manj zanimivi, so pa bili ključni. Potrebno je bilo namreč onemogočiti sistem sistem v gostiteljskih celicah, ki predstavlja obrambo pred tujo DNA, temelji pa na metilacijskem vzorcu DNA. Uporabiti so torej morali celice, ki so imele obrambni sistem onesposobljen. Naslednji pomembni poskusi pa so bili preverjanje funkcionalnosti koščkov sinteznega genoma, dolgih po 100.000 bp. Imeli so 11 takih kosov, ki so jih kombinirali s preostankom kromosoma iz naravnih celic in za vsako od teh kombinacij preverili, ali se celice lahko delijo ali ne. Ugotovili so, da eden od 11 kosov ni bil funkcionalen, kriva pa je bila mutacija, ki so jo nato popravili, končni sintezni genom pa je deloval tako, kot so predvideli.

Vprašanje je seveda, kaj sedaj. Čeprav sintezna celica v resnici ni sintezna, pač pa naravna celica, ki je sprejela sintezno DNA in jo 'vzela za svojo', se zdi, da bo zdaj mogoče v sintezni kromosom vključiti katere koli dodatne gene in s tem pridobiti celice z novimi lastnostmi. A bodimo realni: vključevanje novih genov v genome bakterih (pa tudi višjih organizmov) ni nič takega, česar ne bi znali narediti že danes. Verjetno bo torej prej treba dokončati delo, ki ga je Venter nakazal in tudi reklamiral že pred leti: dokazati bo treba, da je njegov 'minimalni genom' (hipotetični sintezni organizem so takrat imenovali Sintija) res funkcionalen - da torej res ve, katerih približno 400 genov je tistih, ki zagotavljajo življenje. Tu pa se bo spet pojavil problem z gostiteljsko celico, ki bo pripravljena vzeti tak genom in z njim preživeti nekaj generacij... torej je ozko grlo prej oživljanje genoma kot pa sinteza genoma.

Kar je najlažje oglaševati, je bodočnost. Po Venterjevem mnenju bo mogoče z vključitvijo ustreznih genov pripraviti celice, ki bodo sintetizirale goriva, proizvajala cepiva ali nove materiale. Vse prav, vendar če bi res vedeli, katere gene je treba vključiti, bi marsikaj lahko naredili tudi brez 'sintezne celice'. Morda je 'sintezno življenje' na sedanjih temeljih povsem nepotrebno in bi se ga bilo treba lotiti eno stopnjo nižje - z ustvarjanjem protocelic, miminalnim genomom, ali pa - zaradi večje varnosti - z alternativnim genetskim sistemom, ki ni kompatibilen z življenjem, ki se je v evoluciji razvilo na Zemlji. Morda se sliši kot oddaljena znanstvena fantastika, a skupine po svetu so že naredile nekatere korake, ki peljejo v to smer.

19. maj 2010

Naj cvetijo GS drevesa!

Kot poroča New York Times, so v ZDA odobrili sajenje gensko spremenjenih evkaliptusov. Zakaj ravno evkaliptusov? Ker gre za drevesa, ki zelo hitro rastejo, les pa je vsestransko uporaben: za različne lesne izdelke, pa tudi za pripravo celuloze in proizvodnjo papirja, v novejšem času pa tudi za biogoriva. Če uporabimo les dreves, ki hitro rastejo, rabimo manj površine gozda. Za slovenske razmere se to morda zdi nepomembno, saj imamo gozdov veliko, v mnogih delih sveta pa so gozdovi redkost - razlogov, zakaj, je veliko - zaradi erozije, neugodnih klimatskih pogojev, ker so površine posejane s poljščinami ali pa so poseljene.

Evkaliptus je sicer primeren za lesnopredelovalno industrijo, ima pa ameriški evkaliptus (E. grandis) eno slabo lastnost, to je slaba odpornost proti mrazu, zato ga ni mogoče saditi povsod; nasadi so predvsem na Floridi, drugje pa malo zaradi nevarnosti pozeb. Gensko spremenjeni evkaliptus ima vključen gen, ki drevesom omogoča preživetje tudi severneje od Floride, zdaj pa je prišel čas, ko je treba teorijo tudi dokazati.

Na 28 lokacijah s skupno površino 121 hektarov bodo v 7 zveznih državah posadili okrog 200.000 evkaliptusovih dreves. Ministrstvo za kmetijstvo je tokrat odobrila rast dreves, ne pa tudi njihovo kasnejše komercialno izkoriščanje. V razpravi so dobili več kot 12.000 pripomb nasprotnikov GS rastlin in 45 komentarjev zagovornikov, vendar so bila pisma nasprotnikov v veliki večini kopije enega samega. Po preučitvi možnih vplivov GS evkaliptusov so se v pristojnem uradu odločili, da sajenje odobrijo. Samo na eni lokaciji so določili, da drevesa ne smejo cveteti (to praktično pomeni, da bo treba cvetove potrgati, še preden se razvijejo), na ostalih 27 pa bodo smela. Dodatna genetska sprememba, ki so jo uvedli, je ta, da evkaliptusi ne bodo proizvajali peloda, kar pomeni, da ne bo moglo priti do prenosa genske spremembe na druga drevesa.

V ZDA so sicer že odobrili komercialno pridelavo papaje in sliv z GS dreves, verjetno pa ob uspešnem poteku poskusnega sajenja GS evkaliptusov lahko pričakujemo tudi dovoljenje za predelavo GS lesa.

Evkaliptuse biotehnološko razvija podjetje ArborGen, ki predstavlja tudi nekoliko razširjene podatke o svojih tehnologijah izboljšanja lastnosti evkaliptusa, pa tudi drugih drevesnih vrst.

GS evkaliptus izhaja iz hibrida E. grandis x E. urophylla, ki ima vključenih več genetskih sprememb. Selekcijski marker je gen za odpornost proti kanamicinu. Preživetje nenadnih zmrzali mu omogoča gen za transkripcijski faktor CBF pod kontrolo promotorja, ki ga aktivira mraz. CBF nato pospešuje prepisovanje genov za proteine, ki zagotavljajo odpornost proti pozebam. Naslednja genetska sprememba je moška sterilnost, ki jo zagotavlja gen za bakterijsko ribonukleazo barnazo. Da bi bil evkaliptusov les bolj uporaben za proizvodnjo biogoriva, pa so vanj vključili še nekatere gene, ki povzročijo spremembo v zgradbi lignina. natančnejših podatkov, kako so to izvedli, ni mogoče dobiti. Gre torej za rastline, ki imajo vključenih bistveno več genetskih sprememb kot številne poljščine, ki jih trenutno sejejo za hrano, krmo ali za industrijsko predelavo.

Podatke o konstruktih sem povzel iz informacije nasprotnikov GS rastlin.

10. maj 2010

Pangenomika multiple skleroze

Tega pa doslej še ni naredil nihče... verjetno, ker se je zdelo dovolj logično, da imajo enojajčni dvojčki identične genome. Pa vendar so se lotili tovrstne analize. Pregledali so nukleotidna zaporedja dveh parov dvojčic in enega para dvojčkov, pri čemer so izbrali take, pri katerih je eden imel multiplo sklerozo, eden pa ne. Zanimalo jih je, kako je mogoče, da ob (teoretično) identičnem genomu nekdo razvije bolezen, drugi pa ne. Takih primerov je pri multipli sklerozi kar 70 %.

Predhodne genomske analize so pokazale nekatere razlike v genomih obolelih ljudi z multiplo sklerozo in sicer na 18 različnih lokusih. Ves čas pa je bilo tudi jasno, da imajo pomembno vlogo tudi okoljski dejavniki, morda izpostavljenost sončni svetlobi, pa tudi, hm, mesec rojstva.

Najprej so raziskave pokazale to, kar je bilo pričakovati, namreč da so genomi enojajčnih dvojčkov identični. Da bi vseeno poiskali razlike, povezane z genomom, so nato izvedli epigenetske analize metilacijskih vzorcev DNA. Ugotovili so, da so tudi metilacijski vzorci (ki lahko vplivajo na raven izražanja genov) pri enojajčnih dvojčkih identični. Ostala jim je še analiza transkriptoma, torej določitev ravni posameznih mRNA. Rezultat: nobene razlike med enojajčnimi dvojčki. Tak trinivojski pristop bodo verjetno uporabili tudi pri preiskavah drugih zapletenih bolezni; imenovali so ga pangenomski.

Čeprav na področju znanosti velja, da negativnih rezultatov ni mogoče objaviti v prav uglednih revijah, se je tokrat zgodilo prav nasprotno. Zaradi zahtevnosti preiskav so uspeli raziskave objaviti v reviji Nature. Konec koncev so negativni rezultati pangenomskih preiskav jasen znak, da je treba vzroke za sprožitev multiple skleroze treba iskati v okolju, ne v genih. Po drugi strani pa zagovorniki genetskih vzrokov pravijo, da bi bilo treba preveriti genome živčnih celic, ne samo imunskih, saj bi razlika morda bila prav v celicah, ki jih bolezen najhuje prizadane.

Povzetek raziskave je bil objavljen na spletni strani revije The Scientist.

7. maj 2010

Neandertalec (in druge genomske zgodbe)

Danes je v reviji Science izšel članek, v katerem poročajo o določitvi celotnega genoma neandertalca. Mislim, da se je o tem dosežku že nekaj časa govorilo, čeprav se, gledano z razdalje, zdi morda vse skupaj na meji znanstvene fantastike. Iz kosti treh neandertalcev, ki na tem planetu ne živijo več vsaj zadnjih 30.000 let so zbrali dovolj DNA in dovolj dobre kakovosti, da so lahko sestavili celotno genomsko zaporedje in ga primerjali z genomom modernega človeka.

Kosti so pripadale trem neandertalkam, ki so živele na ozemlju današnje Hrvaške pred približno 38.000 leti. Kosti so našli v jami Vindija, ki je znano arheološko najdišče v bližini Varaždina (pravzaprav je še bližje Ormoža). Skupaj so izolirali toliko genomske DNA, da so lahko določili 3 milijarde nukleotidov. Sicer pri danes živečih sorodnih vrstah toliko nukleotidov ne bi zadoščalo za kakovostno določitev genoma, vendar je pri izumrlih vrstah treba biti bolj racionalen. V veliko pomoč pri pripisovanju delnih zaporedij posameznim delom genoma je bilo natančno poznavanje človeškega in nekaterih opičjih genomov. Ko so primerjali sestavljeno neandertalčevo zaporedje z zaporedji genomov ljudi z različnih delov planeta, so ugotovili, da imajo današnji evropejci in azijci med 1 % in 4 % nukleotidov, ki so sicer značilno neandertalski, medtem ko pri afriških genomih niso našli značilno neandertalskih nukleotidov. Iz tega so sklepali, da so se neandertalci in sočasno živeči moderni ljudje med seboj križali v času, ko je moderni človek že zapustil afriško celino. Dokler so bila znana samo delna zaporedja nenadertalčevega genoma, ni bilo nobenega dokaza, da je do tega križanja res prišlo.

Razlika med modernim človekom in neandertalcem je na ravni nukleotidnega zaporedja 0,16 % - ni veliko, je pa dovolj, da razlike niso mogle biti naključne. Skupni prednik obeh vrst je živel pred približno 300.000 leti, nato pa je prišlo do ločitve vrst. Na osnovi zdaj znanih podatkov je bilo mogoče pogledati, kateri geni so se od takrat hitreje spreminjali kot drugi. Lahko bi predpostavili (ni pa nujno), da so prav ti geni tisti, ki nas delajo 'prave ljudi'. Razlike so največje v genih, ki so pomembni za procese presnove, za strukturo kože in skeleta ter za razvoj zavesti.

Kdaj in kako je prišlo do 'izmenjave genetskega materiala', bo težko ugotoviti. Sicer je znanih nekaj antropoloških podatkov, ki so že prej kazala na mešane lastnosti in znana so jamska bivališča, v katerih so živeli tako neandertalci kot moderni ljudje. Verjetno je obdobje sobivanja trajalo celih 10.000 let. Možen scenarij je, da je do mešanja prišlo na Bližnjem Vzhodu, kjer so v nekaterih jamah morda res bivali oboji v istem časovnem obdobju, ko so se neandertalci pred prihajajočo ledono dobo umikali proti jugu. Sicer pa so si bili podobni po načinu življenja (jame, lovstvo) in po orodju, ki so ga izdelovali (pri čemer so baje neandertalci znali delati boljše kamnite konice za kopja). Pravzaprav je morda bolj zanimivo vprašanje, kako da je do mešanja prišlo v tako omejenem obsegu... vse to pa so lahko že izhodišča za kakšen film, ki bo podatkom lahko dodal kakšno dramatično zgodbo.

Sicer pa je določanje genomskih zaporedij ljudi naredilo v zadnjih mesecih nekatere velike korake. Natančneje so analizirali polimorfizem posameznih nukleotidov ljudi, ki živijo v različnih delih Azije in pri tem ugotovili, da je bolj verjetno od večkratnega priliva ljudi z zahoda v zgodovini razvoja človeka prišlo do notranjih selitev. Te rezultate (objavljene decembra v reviji Science) je dobil panazijski konzorcij v okviru Organizacije za človekov genom (HUGO). Ob tem so na primer korejski raziskovalci natančneje raziskali genome petih korejskih moških in petih žensk in določili njihove genomske karte. Pomen genomskih podatkov torej prepoznavajo po vsem svetu, vprašanje pa je, kaj točno nam bodo ti podatki lahko povedali. Glede pomena in pomembnosti genomskih podatkov je bilo ob določitvi prvega človekovega genoma marsikaj videti bolj enostavno kot se je izkazalo z leti.