30. jul. 2007

Sestavljeno genetsko stikalo

Blogger Franc mi je pisal v soboto, da me 'izziva' k razlagi članka, ki je izšel dan pred tem v reviji Cell, ker naj bi ga jaz gotovo dobro obdelal. No, takega vabila (izziva) res nisem mogel zavrniti, čeprav že vnaprej povem, da je tema zapletena. Je sicer s področja sintezne biologije, natančneje s področja genetskih stikal; naslov članka je "Nastavljivo genetsko stikalo na osnovi interferenčne RNA in represorskih proteinov za uravnavane izražanja genov v sesalskih celicah". Če hočemo razumeti vsebino članka, je treba najprej razjasniti nekaj osnovnih pojmov za vse tiste, ki se z molekularnimi vidiki izražanja genov doslej še niste natančneje spoznali.

Genetsko stikalo ponazarja molekulski sistem, ki omogoča, da se izražanje nekega gena vključi ali izključi kot posledica točno določenega stanja v celici. Poenostavljeno gledano izražanje gena predstavlja proces prepisovanja gena (DNA) v mRNA, pri tem procesu pa sodeluje kot ključni encim RNA-polimeraza. Gre torej zato, da neki drugi proteini (v povezavi z ligandi in pogosto ob vezavi na zaporedja DNA) omogočajo RNA-polimerazi prepisovanje gena. Na stikala v osnovi gledamo tako kot pri preprostih stikalih za prižiganje in ugašanje luči. V naslovu pa omenjajo 'nastavljivo stikalo' - tega si lažje predstavljamo kot stikalo z gumbom, pri katerem lahko nastavimo, kako močno bo žarnica svetila.

Pri uravnavanju izražanja bakterijskih genov je v naravi najpogostejši način ta, da se nek protein, ki se imenuje represor, veže na DNA tik ob zaporedju, na katero bi se sicer vezala RNA-polimeraza. S tem fizično onemogoča, da bi se začela sinteza mRNA in gen se torej ne izraža. Šele takrat, ko se razmere v celici spremenijo in se na represorski protein veže nek ligand, se zaradi vezave liganda tridimenzionalna zgradba represorja spremeni do te mere, da se zmanjša moč njegove vezave na DNA. Zato se sprosti z DNA, RNA-polimeraza pa se lahko veže in začne se izražanje gena; nastala mRNA se bo prevajala v protein. To je klasičen pogled na uravnavanje izražanja pri prokariontih, ki je star že 50 let. Pri evkariontih je uravnavanje pogosto obrnjeno - represorje srečamo sorazmerno redko, zato pa so pogostejši aktivatorji, to so proteini, ki RNA-polimerazi olajšajo vezavo na tarčno zaporedje DNA. Šele v zadnjih 10 letih se je izkazalo, da obstaja še nek v osnovi drugačen mehanizem uravnavanja izražanja, pri čemer imajo ključno vlogo zelo kratke molekule RNA, ki se vežejo na mRNA (pri klasičnem načinu se proteini vežejo na DNA) - govorimo o RNA-interferenci.

O interferenčni RNA so tudi nestrokovnjaki slišali par stavkov ob podelitvi lanskih Nobelovih nagrad. Za medicino sta jo dobila dva molekularna biologa, ki sta bolj ali manj naključno odkrila, da tak način uravnavanja res obstaja in ga nato tudi natančneje opisala. V molekularni genetiki gre gotovo za eno od najpomembnejših odkritij v zadnjih 20 letih, znano pa je tudi pod imenom 'utišanje genov, ki ga posreduje dvoverižna RNA'. Proces brez odvečnih poenostavitev predstavlja animacija na straneh revije Nature Reviews. Na kratko povedano gre za to, da v celicah nastane dvoverižna RNA, ki se ob delovanju encimov razcepi na ~25 nukleotidov dolge fragmente. Tista veriga fragmenta, ki ima zaporedje komplementarno mRNA, se veže na mRNA in sproži proces razgradnje mRNA, tako da se protein ne more sintetizirati. V tem primeru torej kratka RNA preprečuje izražanje gena na stopnji med mRNA in prevajanjem v protein, medtem ko pri klasičnem načinu uravnavanja uravnavanje poteka na stopnji med DNA in sintezo mRNA.

Rezultati, objavljeni v članku
Omenil sem že, da je članek s področja sintezne biologije, kar nakazuje, da je šlo za uvedbo novih načinov uravnavanja v celice. Delali so z gojenimi celicami kitajskega hrčka in s človeškimi celicami, kot tarčni gen pa so vzeli protein EGFP, to je genetska različica zeleno fluorescirajočega proteina, ki sicer izhaja iz neke pacifiške meduze. Celice so pripravili tako, da so v osnovi proizvajale EGFP in so torej prod fluorescenčnim mikroskopom žarele zeleno, če pa so uvedli učinkovit mehanizem utišanja, pa zelene fluorescence niso več zaznali. Kasneje so učinkovitost utišanja preizkusili še z nekaterimi drugimi geni in ugotovili, da je ta več kot 99-odstotna. Tako močan nadzor nad izražanjem genov je pomemben pri pripravi genskih konstruktov, ki jih uporabljamo pri raziskavah, saj moramo biti prepričani, da je nek učinek, ki ga spremljamo, res posledica izražanja točno določenega gena. Če ne moremo zagotoviti popolne odsotnosti nekega genskega produkta, lahko dobimo napačne rezultate.

Avtorji članka so pripravili sestavljeni konstrukt, ki so ga imenovali genetsko omrežje, gre pa za povezavo genetskih elementov, ki se medsebojno uravnavajo. Posamezne stopnje v sestavljanju 'omrežja' so predhodno preizkusili in dokazali, da delujejo. Izhodišče je dobro znani sistem uravnavanja laktoznega operona pri bakterijah, pri katerem se represorski protein (LacI) veže na nukleotidno zaporedje lacO v bližini mesta vezave RNA-polimeraze. Že pred precej leti so vedeli, da ta sistem dovolj dobro deluje tudi v genetsko spremenjenih sesalskih celicah. Represor se je izražal neprestano in je preprečeval, da bi se sintetizirali dve drugi mRNA: zapis za tetraciklinski represor (TetR) in zapis za EGFP, ki sta bila vstavljena v istem konstruktu navzgor in navzdol od zapisa za LacI. Ker se TetR ni sintetiziral, je bilo neovirano izražanje kratke interferenčne RNA, ki se je vezala na del 'gena' za EGFP in s tem dodatno preprečevala razvoj zelene fluorescence. Po dodatku liganda (izopropil-tiogalaktopiranozida, IPTG), ki deluje kot induktor, se je stikalo vključilo. Represor se ni več mogel vezati na tarčna mesta, zato se je začela sinteza tetraciklinskega represorja, ta pa se je vezal na mesta (tetO) pred zapisom za interferenčno RNA, zato se iRNA ni vezala na mRNA za EGFP, hkrati pa laktozni represor ni več preprečeval sinteze mRNA za EGFP in celice so začele fluorescirati.



Z meritvami so dokazali, da je bila raven izražanja EGFP sorazmerna koncentraciji induktorja (IPTG) in so zato sistem uravnavanja imenovali 'nastavljiv': več ko so dodali IPTG (razpon testiranih koncentracij je bil od 250 pM do 1 mM), močneje so celice fluorescirale.

Uvedba novega načina uravnavanja izražanja v sesalske celice ima kljub nekaterim prepričljivim dobrim stranem po mojem mnenju tudi vsaj dve pomanjkljivosti. Nastavljivost je zelo groba: v poskusih niso uporabili nobene take koncentracije IPTG, da bi bila raven izražanja EGFP med 20 % in 70 %, hkrati pa je odziv celic sorazmerno počasen. Od trenutka, ko celicam dodajo IPTG, do maksimalnega odgovora (raven EGFP) traja 2 dneva, po odvzemu IPTG pa do ničelne ravni EGFP v celicah traja tri dni.

Da je uvedeno genetsko stikalo zelo učinkovito in da je uporabno za raziskave celičnih procesov, so dokazali s tem, da so na primer namesto zapisa za EGFP v konstrukt vstavili zapis za alfa verigo difterijskega toksina (ki, če se izraža, celico ubije) ali zapis za protein Bax, ki sproži programirano celično smrt. Brez induktorja so celice z zapisom za toksin gojili 4 tedne brez vidnega učinka na njihovo rast in obliko, po dodatku induktorja pa se je njihova morfologija spremenila in so odmrle. Pri konstruktu z zapisom za Bax pa so ugotovili, da je bilo preživetje odvisno od ravni izražanja.

25. jul. 2007

Daniel E. Koshland Jr. (1920-2007)

Predvčerajšnjim je za posledicami kapi umrl ugledni biokemik Dan Koshland. Dobrih 10 let je bil urednik revije Science, pomemben pa je tudi njegov prispevek k razvoju ved o življenju na univerzi Berkeley v Kaliforniji. Kot biokemik se je v svojih raziskovalnih letih ukvarjal z encimatiko in tako že ob koncu petdesetih let razvil model 'induciranega prileganja' substrata in encima. Dotlej je namreč večina biokemikov to interakcijo razumela po principu 'ključa in ključavnice'. Izkazalo pa se je, da sta tako substrat kot žep aktivnega mesta na encimu fleksibilna interakcijska partnerja in njegova teorija v osnovi še vedno velja.

Dan Koshland je diplomiral iz kemije leta 1941 in je kmalu zatem sodeloval pri projektu Manhattan (razvoj atomske bombe). Doktoriral je iz organske kemije leta 1949. Po skoraj dveh desetletjih dela na področju encimatike je v 70-tih raziskoval kemotaksijo pri bakterijah in ob tem preučeval lastnosti receptorskih molekul in prenos signalov s površine celice v notranjost. Nazadnje se je ukvarjal še z bioenergetiko (proizvodnja metana s pomočjo cianobakterij). Bil je profesor molekularne in celične biologije, član Ameriške akademije znanosti, bil je predsednih Ameriškega društva bioloških kemikov, prejemnik več častnih doktoratov znanosti in drugih znanstvenih priznanj.

Povzeto po novici univerze Berkeley.

Botaniklici

'Botanicalls' je naslov projekta skupine (seveda) ameriških podiplomskih študentov. Lotili so se problema premalo ali preveč zalitih rastlin. Senzorje za vlago so povezali z računalniškim vmesnikom, ki pri prekoračitvi postavljenih meja sproži telefonski klic lastniku in posnet glas, ki se predstavi kot rastlina, pove, da je na primer premalo zalita. Ko jo zalijemo, ponovno dobimo klic in rastlina se zahvali, da je dovolj zalita. Da bo stvar še bolj zanimiva, ima vsaka rastlina drugačen glas in baje škotski mah celi govori s škotskim naglasom, čeprav rastlina sploh ne izhaja s Škotske. Glede na to, da senzorji za vlago niso nič novega in nenavadnega, je edina novost projekta dodajanje glasu in s tem (na videz) neposredna komunikacija med rastlino in človekom.

Novico povzemam po sporočilu agencije Reuters.

24. jul. 2007

Energija iz človeške krvi

Tokrat ne gre za poganjanje avtomobilov, pač pa za energijo za delovanje biosenzorjev in drugih nanonaprav v medicini. Kot piše v sestavku na Softpediji, na Georgijskem tehnološkem inštitutu v ZDA razvijajo napravo, ki bi delovala kot nanogenerator in bi črpala energijo iz krvožilnega sistema. Zadoščala bi pretvorba (mehanske) energije utripanja srca in krženja žil v električno energijo. Gre za moči reda velikosti mikroamperov, vendar so doslej s poskusi uspeli doseči le nanoamperske moči, tako da jih čaka še veliko dela. Naprava bi delovala potopljena v tekočino, ki se premika, sestavljena pa je iz ustrezno oblikovanih nanožic. Morda bi lahko kdaj na tak način poganjali tudi osebno elektroniko.
Zanimiva je tudi razprava na to temo, ki poteka na portalu Slashdot (v dveh dneh se je nabralo več kot 150 komentarjev). Nekdo je izračunal, da bi pri 1-odstotnem izkoristku za poganjanje takega nanogeneratorja porabili skupaj 1 kalorijo dnevno. Drugi so skeptični, da bi naprava bila uporabna, saj je nevarnost nastanka krvih strdkov ali razvoja okužb prevelika, težave pa bi znale biti tudi hidrodinamske.

22. jul. 2007

Gorivo iz izpušnih hlapov...

To bi bilo seveda preveč enostavno, a Reuters se o tem v svoji novici ne sprašuje: Ogljikov dioksid iz izpušnih hlapov je mogoče shraniti, ga v bazenih uvajati algam, ki ga pretvorijo v metan in olje, olje pa lahko uporabimo kot biodizel za poganjanje motorjev z notranjim izgorevanjem. Perpetuum mobile? Pravzaprav ne. O izkoristku, ceni in tehnologiji ni znanega še nič, čeprav naj bi trije iznajditelji iz Walesa svoj izum preizkušali še več kot dve leti.

Ideja sicer ni slaba: škatla, ki so jo imenovali Greenbox, veže več kot 85 % nečistoč, ki nastajajo pri izgorevanju v motorju. Kapaciteta nosilca naj bi ustrezala količini nečistoč, ki nastanejo pri porabi enega avtomobilskega rezervoarja goriva, škatlo z vezanimi nečistočami pa bi ob naslednjem polnjenju goriva na črpalki oddali v recikliranje. V zbirnih centrih bi nato vezane snovi, predvsem CO2, sprostili z nosilca in ga uvedli v bazene z algami. Gensko spremenjene alge bi ogljikov dioksid vezale v organsko snov, to pa bi nato ponovno uporabili. Izumitelji se sicer ukvarjajo z gojenjem rib, po stroki pa sta dva inženirja in en organski kemik.

Jasno je, da bo postopek, tudi če bo izvedljiv, drag in njegov izkoristek bo relativno majhen, kar se tiče deleža reciklirane energije. Verjetno je prej treba na vse skupaj gledati kot na prispevek v boju proti onesnaževanju kot pa na resen alternativni vir energije. Tudi zaradi uporabe koruze in pšenice za pripravo biogoriv se je na primer cena pšenice glede na lansko ceno podvojila, tako da bo treba poiskati alternativne vire, ki ne bi bili vezani na kulture, uporabne v prehrani ali kot krmila za živali.

17. jul. 2007

Kari tudi proti Alzeimerju

Kari (curry) je sicer priljubljena indijska jed, že dolgo nazaj pa so ugotovili, da ena njegovih glavnih sestavin, kurkuma, vsebuje antioksidante in druge snovi, ki delujejo med drugim tudi protitumorsko. Kurkuma ne vsebuje samo kurkumina, pač pa še vrsto drugih organskih molekul s fiziološkim učinkom.

Včeraj pa je agencija Reuters sporočila, da naj bi sestavina karija delovala tudi proti Alzheimerjevi bolezni, o čemer naj bi izšel članek v ugledni reviji PNAS. V raziskavi so ugotovili, katera sestavina kurkume ima najmočnejši učinek proti Alzheimerjevi bolezni. Identificirali so spojino bisdemetoksikurkumin, ki je delovala na makrofage, tako da so bili sposobni odstranjevati proteinske skupke, ki bi sicer poškodovali možganske celice in privedli do razvoja značilnih bolezenskih znakov. Proteinske skupke sestavlja amiloid beta, to je približno 40 aminokislinskih ostankov dolg peptid, ki se izcepi iz večjega prekurzorskega proteina (APP), vstavljenega v membrano. (Biosintezo amiloida beta prikazujejo naslednje tri slike: 1 - 2 - 3.)

Bisdemetoksikurkumin bi bilo mogoče v telo dovesti z infuzijo, saj je verjetno težko pojesti toliko karija, da bi dosegli dovolj visoko koncentracijo učinkovine v telesu.

10. jul. 2007

Korejci bi klonirali službene pse

Korejska carina je podpisala dogovor z laboratorijem, ki je leta 2005 kot prvi kloniral psa, afganistanskega hrta, ki so ga imenovali Snuppy (SNU = Seoul National University). Laboratorij, ki ga je pred leti vodil kontroverzni raziskovalec Hwang Woo-Suk, je doslej uspešno kloniral že več psov in korejskega sivega volka. Tokrat pa cariniki želijo klonirati pse, ki so sposobni izslediti prepovedane droge, poroča Reuters. Kloniranje enega psa naj bi stalo med 40.000 in 80.000 EUR, Reutersovi novinarki pa se zdi predvsem zanimivo, ali bo to prvi korak na poti h kloniranju hišnih ljubljencev.

Verjetno je pravo vprašanje, ali bo klonirani pes res sposoben zaznavati droge in nanje opozoriti carinika, ki bo psa vodil. Mislim, da bodo cariniki presenečeni...

9. jul. 2007

Razlike med celicami: epigenetski pogled

Nove tehnike za določanje nukleotidnih zaporedij, ki temeljijo na tako imenovanem 'masivno vzporednem' pristopu (gre za desettisoče ali stotisoče reakcij, ki potekajo neodvisno, a hkrati, v pikolitrskih volumnih), omogočajo tudi analizo drugih lastnosti nukleotidnih zaporedij. Tako so ameriški raziskovalci z eno od novih tehnik uspeli natančneje analizirati proteinske oznake na kromosomih. Razporeditev proteinov v kromatinu je namreč v različnih celicah različna. Čeprav so včasih menili, da imajo v kromatinu proteini le vlogo pri kompaktiranju DNA, danes vemo, da imajo proteini - histoni - tudi pomembno regulacijsko vlogo. Zato proteinske oznake predstavljajo eno od epigenetskih značilnosti (za razliko od genetskih, ki pomenijo nukleotidna zaporedja, so epigenetske značilnosti na primer metilacija nukleotidov in razporeditev in modifikacije proteinov, vezanih na DNA).

V raziskavi, ki so jo predčasno objavili na spletni strani revije Nature 1. julija, so primerjali vzorce vezanih proteinov pri treh tipih mišjih celic: embrionalnih izvornih celicah in dveh tipih celic, ki so že delno diferencirane v smeri proti živčnim celicam in proti fibroblastom. Govorijo o kartiranju kromatina in kromatinski pokrajini celotnega genoma, ki daje vpogled v razvoj celice in vsaj delno razloži razlike med različnimi celicami, ki imajo vendarle identično zaporedje nukleotidov v genomu. Gre za način vklapljanja in izklapljanja genov (pravzaprav vključevanje in izključevanje prepisovanja DNA v RNA).

Preiskovali so predvsem trimetilacije posameznih lizinskih ostankov na histonih in ugotovili, da imajo posamezni lizini v strukturi histonov točno določen pomen za razločevanje aktivnih in neaktivnih regij genoma, zato lahko metilacijske oznake na histonih, vezanih na neko zaporedje, predstavljajo kode za razumevanje delovanja kromatina.

5. jul. 2007

Nanodelci na eritrocitih

Polimerni nanodelci so sicer obetajoči prenašalci zdravil, vendar njihovo uporabnost za zdravljenje zmanjšuje njihova slaba obstojnost v telesu. Makrofagi jih namreč fagocitirajo že v nekaj minutah, zato se večina zdravila, ki ga prenašajo, lahko odstrani, še preden doseže tarčne celice.

V julijski številki revije Experimental Biology and Medicine, ki izide pojutrišnjem, bo objavljen članek, v katerem kalifornijski raziskovalci poročajo, da so nanodelci bistveno bolj obstojni, če jih pritrdijo na površino eritrocitov. S tem eritrociti ostanejo enako funkcionalni, nanodelci pa se izognejo fagocitozi in teoretično lahko v obtoku ostanejo, dokler se eritrocit ne razgradi (v povprečju okoli 4 mesece).

Raziskave so vendarle šele v začetnih fazah, zato bo treba pred uporabo rešiti še veliko odprtih problemov. Med njimi je stabilnost vezave nanodelcev na površino eritrocita, pomembno pa je tudi, da je tak način zaščite nanodelcev primeren je za prenašanje zdravil, ki so učinkovita v imobilizirani obliki.

Novico povzemam po EurekAlert.

3. jul. 2007

Genografski projekt

Z razjasnitvijo človekovega genoma se je delo pravzaprav šele začelo - vsaj danes se včasih tako zdi. Epigenom, genom raka, primerjalna genomika,... zdaj pa se je pojavila še genografija. Gre za povezavo genetskih podatkov z antropološko-geografskimi podatki. Prvi znanstveni članek, ki opisuje začetne rezultate projekta, je izšel 29. junija v reviji PLoS Genetics. V prvem letu in pol, kar (sicer petletni) projekt poteka, so analizirali mitohondrijsko DNA 78.590 ljudi. Podatki so javno dostopni in jih bodo še dopolnjevali. Eden od ciljev projekta je razvrstiti ljudi v haploskupine (z enakimi genetskimi značilnostmi na ravni nukleotidnega zaporedja) in na osnovi mitohondrijskih zaporedij ugotoviti migracijske poti človeka v zgodovini.

V projektu sodeluje 10 raziskovalnih skupin. Morda je zabavno, po svoje pa tudi zanimivo, da lahko v genografskem projektu sodeluje vsakdo. Pogoj je, da kupi 'genografski komplet', ki stane okrog 100 EUR in po pošti pošlje vzorec celic ustne sluznice. V laboratoriju ene od sodelujočih raziskovalnih skupin nato izolirajo DNA in jo analizirajo. Pri ženskah določijo nukleotidno zaporedje hipervariabilne regije 1 mitohondrijske DNA (dolgo je okrog 500 bp) in preverijo še 22 variabilnih mest v kodirajočih regijah mitohondrijske DNA. Pri moških analizirajo lokuse s kratkimi tandemskimi ponovitvami na kromosomu Y in polimorfizme posameznih nukleotidov.

Razlago raziskave predstavlja obvestilo za javnost PLoS. Medijsko in strokovno podporo projektu zagotavlja National Geographic Society, računalniško pa IBM. Kot piše tudi na Wikipediji, pa združenja starih ljudstev (predvsem indijanskih plemen v ZDA) pozivajo k bojkotu projekta. Čeprav brez vzorcev pripadnikov starih ljudstev slika ne bi bila popolna, so doslej baje zbrali že več kot 25.000 vzorcev izvornih prebivalcev posameznih celin.