5. mar. 2009

Določanje prostorske zgradbe proteinov v živih celicah

Določitev prostorske strukture proteina je v proteinski biokemiji (še vedno) raziskovalni dosežek, ki daje odgovore na številna vprašanja o delovanju proteina, omogoča racionalno načrtovanje molekul, ki bi zavrle aktivnost proteina in podobno. Doslej je veljalo, da je za določanje strukture treba pripraviti zadostne količine proteina v povsem čisti obliki. Zadostne količine pomeni pogosto vsaj 10 mg... kar se mogoče marsikomu zdi zelo malo, saj je komaj mogoče stehtati. Vendar pa si morate predstavljati, da so proteini v celicah lahko izredno aktivni in za normalno delovanje celic zadošča že nekaj deset ali nekaj sto kopij nekega proteina v posamezni celici. Zdaj pa malo matematike:

Ena bakterijska celica vsebuje približno 10E(-10) mg proteinov in v 1 litru bakterijske kulture je približno 10E9 celic. To pomeni, da iz enega litra bakterijske kulture lahko dobimo okrog 100 mg proteinov. Toda gre za vse bakterijske proteine skupaj. Če nek protein, ki nas zanima, predstavlja 0,1 % od vseh proteinov v celici (kar niti ni tako malo), potem iz enega litra, če ne bi bilo nobenih izgub pri izolaciji, lahko dobimo 0,1 mg tega proteina. Z drugimi besedami: za 10 mg tega proteina bi morali pripraviti 100 litrov bakterijske kulture. Lahko si predstavljate, da so raziskovalni laboratoriji večinoma opremljeni za delo z največ par litri kulture hkrati. Problem je nadalje v tem, da pri izolaciji proteinov iz celičnih lizatov vedno prihaja do izgub. Izpleni, ki dosežejo več kot 20-30 %, veljajo za visoke, kar spet pomeni, da bi morda izolacijo morali začeti iz 300 litrov bakterijske kulture - nepredstavljivo za veliko večino laboratorijev, razen industrijskih.

Ta dolg uvod je bil potreben, da bi bolje razumeli pomen dveh člankov, ki sta objavljena v današnji izdaji revije Nature. Raziskovalcem je uspelo določiti prostorsko strukturo proteina, ki ni bil izoliran. V bakterijah so pripravili rekombinantni protein na tak način, da so bakterije med rastjo v proteine vgrajevale z izotopoma N-15 in C-13 označene hidrofobne aminokisline, protein pa so prekomerno izrazili (to pomeni, da je protein dosegel v celici >20 % mase vseh celičnih proteinov). Z jedrsko magnetno resonanco (NMR) so nato določili spektre proteina, ko je bil ta še v celici, torej brez izolacije.

Pomen tovrstnih eksperimentov je vsaj dvojen. Prvič, ni potrebno včasih zahtevno čiščenje proteina iz celičnih lizatov, in drugič, proteini v celicah imajo lahko nekoliko drugačno prostorsko strukturo, ko so v naravnem okolju in vstopajo v interakcije z drugimi molekulami, kot pa v izolirani obliki.

Eden od člankov opisuje delo z bakterijami, drugi pa določitev treh struktur v živih človeških celicah. Čeprav se zdi, da so s tem odprte poti za enostavno in hitro določanje strukture kateregakoli proteina v živi celici, pa temu ni tako, saj je predpogoj, da so signali proteina, ki ga preučujemo, dovolj močni in da meritve lahko opravimo v dovolj kratkem času, da celice preživijo. Do rutinskega določanja novih struktur poljubnih proteinov v živih celicah bo preteko še precej vode.

Predstavitev dosežka je na straneh revije Nature, opis ene od raziskav pa tudi na EurekAlert.

3 komentarji:

Bashi pravi ...

Wow
Žal nimam dostopa do Nature člankov, samo na hitro, kako so izločili šum ostalih celičnih proteinov, predvsem tistih v največjem procentu (strukturni)?

Marko Dolinar pravi ...

Mislim, da je bilo ključno to, da so protein res izrazili prekomerno. Sicer nikjer v resnici ne zapišejo, koliko to je (običajno bi rekli, da rekombinantni protein predstavlja npr. 30 % vseh bakterijskih proteinov) - edini podatek, iz katerega bi lahko sklepali na delež rekombinantnega proteina je, da je bil v vzorcu prisoten v 3-4 mM koncentraciji. Protein je bil velik ~7 kDa. Na prvi izračun bi rekel, da je to IZREDNO močno izražen protein. Omenjajo še drug protein (kalmodulin, 17 kDa), ki so ga imeli v ~1 mM koncentraciji (podobno ogromno) in pravijo, da bi se še vedno dalo določiti spektre. Po mojem je pomembno tudi to, celice prestavijo v izotopsko gojišče hkrati z indukcijo izražanja. Če celice res intenzivno izražajo rekombinantni protein, potem je sinteza lastnih proteinov zelo počasna in signali N-15 in C-13 pripadajo v pretežni meri rekombinantnemu proteinu.

Smoki pravi ...

Wowsers. Tudi če gre za osamljen primer, ki še zlepa ne bo ugledal široke rabe (ali pa prav zato, kakor obrnemo), je dosežek izjemen.

Žive celice gor ali dol, zelo pomemben se mi zdi že vsak korak proti metodam, ki bodo za določitev strukture zahtevale nekoliko manj čist protein.