Wolbachia je rod bakterij, ki živijo kot paraziti znotraj nevretenčarskih celic. Najpogosteje se naselijo v spolnih organih žuželk in rakov in prehajajo iz generacije v generacijo gostiteljev. Njihovo prisotnost je mogoče dokazati s citološkimi in imunološkimi tehnikami, pa tudi z genetskimi. Tu pa nastopi problem, ki so se ga znanstveniki zavedli šele zdaj: ugotovili so, da gostiteljski genom lahko vključuje velike dele parazitove DNA, morda celo celoten parazitski genom. O zanimivem odkritju, ki bo objavljeno v reviji Science, poroča EurekAlert.
V genomu vinske mušice Dropsohila ananassae so namreč v 2. kromosomu našli kopije praktično vseh genov parazitske volbahije in ugotovili, da se vsaj nekateri geni prepisujejo tudi pri tistih vinskih mušicah, ki sploh niso okužene s paraziti.
Raziskovalci menijo, da so volbahije paraziti v 70 % vseh nevretenčarjev na planetu, kar je skoraj nepredstavljivo in še najbolj podobno dogajanju iz zgodnje evolucije evkariontov - 'vselitvi' (bodočih) mitohondrijev, ki so postopno velike dele svojega genoma preselili v jedrno DNA.
Po drugi strani dokazana prisotnost bakterijskih genov v genomu vinske mušice pomeni, da je morda treba ponovno kritično pregledati rezultate dosedanjih genomskih analiz. Doslej so namreč pri določanju genomskih zaporedij višjih evkariontov prisotnost bakterijskih zaporedij vedno obravnavali kot kontaminacijo iz procesa izolacije genomske DNA (bakterije bi lahko bile na površini celic, iz katerih izolirajo jedrno DNA) in je niso upoštevali. Predvsem pri členonožcih pa bi bilo treba natančno pregledati, ali morda ne vsebujejo genov volbahije ali kakšnih drugih bakterij, ki bi se lahko v genom preselili v procesu evolucije.
30. avg. 2007
27. avg. 2007
Genom vinske trte
Francosko-italijanski javni konzorcij za karakterizacijo genoma vinske trte bo v reviji Nature objavil rezultate svojega dosedanjega dela in predstavil delovno verzijo trtinega genoma. Analizirali so navidezno homozigotno sorto modrega pinota s hitro metodo na celotnem genomu (whole genome shotgun). Gre za drugi genom lesnate rastline in prvo sadno vrsto, ki so ji določili genom. Trtin genom obsega 487 milijonov baznih parov in zapisuje za okoli 30.000 proteinov, to je manj kot so ugotovili za genom riža (37.000) in topola (45.000).
Za raziskovalce je posebej zanimivo, da bi lahko nekatere organoleptične in biokemijske lastnosti vin pravzaprav določili na ravni genoma, saj so vinorodne sorte v procesu selekcije pridobile dodatne kopije nekaterih genov. Enako velja za gene, katerih produkti sodelujejo v biosintezni poti resveratrola, fitoaleksina, za katerega menijo, da je odgovoren za pozitivne lastnosti, povezane z uživanjem rdečega vina. Prav tako je pomembno, da lahko s primerjavo genomov sort ali sorodnih vrst, ki so odporne proti nekaterim boleznim, določijo gene, ki bi jih morda bilo mogoče prenesti v občutljive sorte vinske trte.
V nadaljevanju bodo natančneje določili genom enega od sevov kvasovke, ki jo uporabljajo za vretje mošta, verjetno pa tudi genome patogenov, ki napadajo trto.
O objavi trtinega genoma sta poročala npr. Reuters in TechnologyReview (MIT), članek pa je izšel kot predčasna objava v reviji Nature (ki je včeraj tudi objavila novico na svojih spletnih straneh).
Za raziskovalce je posebej zanimivo, da bi lahko nekatere organoleptične in biokemijske lastnosti vin pravzaprav določili na ravni genoma, saj so vinorodne sorte v procesu selekcije pridobile dodatne kopije nekaterih genov. Enako velja za gene, katerih produkti sodelujejo v biosintezni poti resveratrola, fitoaleksina, za katerega menijo, da je odgovoren za pozitivne lastnosti, povezane z uživanjem rdečega vina. Prav tako je pomembno, da lahko s primerjavo genomov sort ali sorodnih vrst, ki so odporne proti nekaterim boleznim, določijo gene, ki bi jih morda bilo mogoče prenesti v občutljive sorte vinske trte.
V nadaljevanju bodo natančneje določili genom enega od sevov kvasovke, ki jo uporabljajo za vretje mošta, verjetno pa tudi genome patogenov, ki napadajo trto.
O objavi trtinega genoma sta poročala npr. Reuters in TechnologyReview (MIT), članek pa je izšel kot predčasna objava v reviji Nature (ki je včeraj tudi objavila novico na svojih spletnih straneh).
9. avg. 2007
Razen oksidativnega tudi reduktivni stres
V jutrišnji številki revije Cell bo izšel članek, iz katerega je mogoče sklepati, da je naravnanost ljudi v boj proti oksidantom v telesu morda nesmiselna. Z uživanjem antioksidantov (na primer vitaminov A in C) se borimo proti prostim radikalom in oksidativnemu stresu, vendar s tem organizmu ne delamo kakšne posebne usluge. Bolj kot odsotnost oksidantov je namreč pomembno ravnotežje med oksidanti in reducenti v telesu.
Mnogi celični procesi, povezani z nastajanjem in porabljanjem energije, temeljijo na biokemijskih pretvorbah molekul, med katerimi so reducenti zelo pomembni. Reducenti (antioksidanti) so snovi, ki zlahka oddajo elektron (in se ob tem oksidirajo), tega pa sprejme oksidant (in se ob tem reducira). Pri oksidativnem stresu pride v telesu do pomanjkanja reducentov, kar vemo, da lahko privede do razvoja različnih bolezni. Tokrat pa so (prvič pri sesalcih) ugotovili, da tudi visoka koncentracija antioksidantov lahko pripelje do okvar srčne mišice.
Raziskave so izvedli na miših z mutacijo v genu za alfa kristalin, ki je povzročila razvoj mišičnih okvar zaradi nabiranja proteinskih skupkov v mišicah, predvsem v srčni. Odkrili so, da so simptomi enaki kot pri ljudeh, ki imajo enako mutacijo: povečano srce, njegovo postopno čedalje šibkejše delovanje in predčasna smrt. Analiza srčnih mišic je pokazala, da je bila mišica v reduktivnem stresu, čeprav so na začetku raziskave pravzaprav pričakovali, da bodo našli stanje oksidativnega stresa. Vendar pa so ugotovili, da stresno stanje (zaradi proteinskih skupkov) najprej povzroči nastajanje reaktivnih kisikovih zvrsti, te pa telo poskuša nevtralizirati s tem, da v obolelo tkivo pritegne antioksidante, predvsem reducirani glutation. Stanje postopno uide nadzoru in glutationa se nabere toliko, da srčna mišica doživi reduktivni stres.
Ko so podobne analize izvedli na miših z nižjo ravnjo antioksidantnega encima glukoza-6-fosfat-dehidrogenaze (G6PD), so ugotovili, da se simptomi, značilni za bolezen, kljub mutaciji niso razvili. To pa pomeni, da bi lahko bolezen, ki jo povzročajo proteinski agregati v mišicah in za katero natančnega razvoja bolezni še ne razumemo v celoti, lahko zdravili s snovmi, ki delujejo zaviralno na G6PD. Morda je podoben mehanizem tudi v ozadju razvoja drugih bolezni, ki so posledica nastajanja proteinskih agregatov, teh pa poznamo veliko. Med bolj znanimi sta Alzheimerjeva in Huntingtonova bolezen.
Novico povzemam po sporočilu Cell Press na portalu EurekAlert.
Mnogi celični procesi, povezani z nastajanjem in porabljanjem energije, temeljijo na biokemijskih pretvorbah molekul, med katerimi so reducenti zelo pomembni. Reducenti (antioksidanti) so snovi, ki zlahka oddajo elektron (in se ob tem oksidirajo), tega pa sprejme oksidant (in se ob tem reducira). Pri oksidativnem stresu pride v telesu do pomanjkanja reducentov, kar vemo, da lahko privede do razvoja različnih bolezni. Tokrat pa so (prvič pri sesalcih) ugotovili, da tudi visoka koncentracija antioksidantov lahko pripelje do okvar srčne mišice.
Raziskave so izvedli na miših z mutacijo v genu za alfa kristalin, ki je povzročila razvoj mišičnih okvar zaradi nabiranja proteinskih skupkov v mišicah, predvsem v srčni. Odkrili so, da so simptomi enaki kot pri ljudeh, ki imajo enako mutacijo: povečano srce, njegovo postopno čedalje šibkejše delovanje in predčasna smrt. Analiza srčnih mišic je pokazala, da je bila mišica v reduktivnem stresu, čeprav so na začetku raziskave pravzaprav pričakovali, da bodo našli stanje oksidativnega stresa. Vendar pa so ugotovili, da stresno stanje (zaradi proteinskih skupkov) najprej povzroči nastajanje reaktivnih kisikovih zvrsti, te pa telo poskuša nevtralizirati s tem, da v obolelo tkivo pritegne antioksidante, predvsem reducirani glutation. Stanje postopno uide nadzoru in glutationa se nabere toliko, da srčna mišica doživi reduktivni stres.
Ko so podobne analize izvedli na miših z nižjo ravnjo antioksidantnega encima glukoza-6-fosfat-dehidrogenaze (G6PD), so ugotovili, da se simptomi, značilni za bolezen, kljub mutaciji niso razvili. To pa pomeni, da bi lahko bolezen, ki jo povzročajo proteinski agregati v mišicah in za katero natančnega razvoja bolezni še ne razumemo v celoti, lahko zdravili s snovmi, ki delujejo zaviralno na G6PD. Morda je podoben mehanizem tudi v ozadju razvoja drugih bolezni, ki so posledica nastajanja proteinskih agregatov, teh pa poznamo veliko. Med bolj znanimi sta Alzheimerjeva in Huntingtonova bolezen.
Novico povzemam po sporočilu Cell Press na portalu EurekAlert.
5. avg. 2007
Ko bi Hwang Woo-Suk vedel...
Hwang Woo-Suk je korejski raziskovalec, ki je zaslovel leta 2004 s kloniranjem človeških celic, a se je kasneje izkazalo, da so bili rezultati potvorjeni. 'Primer Hwang' je konec leta 2005 prišel na naslovnice časopisov in med vodilne novice elektronskih medijev. Ko le že kazalo, da bo Hwang skupaj z rezultati počasi potonil v pozabo, pa so raziskovalci natančno analizirali genom celičnih linij, za katere je Hwang trdil, da jih je dobil s postopkom jedrnega prenosa. Rezultate so objavili v četrtek kot predhodno objavo (tudi kot PDF) na spletni strani revije Cell - Stem Cell (izhajati je začela letos, tako da je doslej izšla šele ena številka, a bo glede na ugled revije Cell in aktualnost področja, skoraj zagotovo obstala). Novico sicer povzemam po sporočilu za javnost Bostonske otroške bolnišnice, vrhunske raziskovalne in zdravstvene ustanove (z več kot 500 raziskovalci in s 347 bolniškimi posteljami).
Raziskave so pokazale, da so celične linije, ki izhajajo iz laboratorija dr. Hwanga, v resnici diploidni kloni jajčnih celic! Celična linija je torej nastala v procesu partenogeneze, za katero je doslej veljalo, da pri človeku ne more privesti do več kot parceličnega stadija. Da celica postane diploidna, se morajo kromosomi jajčne celice podvojiti in tako nastane v osnovi homozigotna celica (kromosoma sta si enaka). Šele zelo natančna analiza je pokazala, da pri podvojitvi prihaja do nekaterih zamenjav delov, ki se pojavljajo predvsem na koncih kromosomov, kjer so našli heterozigotne regije.
Z razjasnitvijo narave Hwangovih celičnih linij, ki so torej partenogenetske linije, je znanost dobila novo močno orodje za pripravo embrionalnih izvornih celic. Doslej so partenogenezo inducirali kvečjemu pri miših, pri ljudeh pa ni kazalo, da bodo poskusi kmalu uspešni. Če bi Hwang vedel, da je kot prvi pripravil partenogenetsko človeško celično linijo, to verjetno ne bi bil nič manjši uspeh kot je (oziroma ni) bila celična linija dobljena z jedrnim prenosom.
Avtorji članka trdijo, da je zaradi ponarejenih rezultatov kloniranje človeških celic po letu 2006 nekoliko zastalo, kar se gotovo ne bi zgodilo, če bi bili že takrat znani rezultati analiz korejskih celic, ki bodo objavljeni letos.
Intervju z vodilnim avtorjem članka, Georgom Dahleyem, si lahko ogledate v več krajših videih na strani Bostonske otroške bolnišnice.
Raziskave so pokazale, da so celične linije, ki izhajajo iz laboratorija dr. Hwanga, v resnici diploidni kloni jajčnih celic! Celična linija je torej nastala v procesu partenogeneze, za katero je doslej veljalo, da pri človeku ne more privesti do več kot parceličnega stadija. Da celica postane diploidna, se morajo kromosomi jajčne celice podvojiti in tako nastane v osnovi homozigotna celica (kromosoma sta si enaka). Šele zelo natančna analiza je pokazala, da pri podvojitvi prihaja do nekaterih zamenjav delov, ki se pojavljajo predvsem na koncih kromosomov, kjer so našli heterozigotne regije.
Z razjasnitvijo narave Hwangovih celičnih linij, ki so torej partenogenetske linije, je znanost dobila novo močno orodje za pripravo embrionalnih izvornih celic. Doslej so partenogenezo inducirali kvečjemu pri miših, pri ljudeh pa ni kazalo, da bodo poskusi kmalu uspešni. Če bi Hwang vedel, da je kot prvi pripravil partenogenetsko človeško celično linijo, to verjetno ne bi bil nič manjši uspeh kot je (oziroma ni) bila celična linija dobljena z jedrnim prenosom.
Avtorji članka trdijo, da je zaradi ponarejenih rezultatov kloniranje človeških celic po letu 2006 nekoliko zastalo, kar se gotovo ne bi zgodilo, če bi bili že takrat znani rezultati analiz korejskih celic, ki bodo objavljeni letos.
Intervju z vodilnim avtorjem članka, Georgom Dahleyem, si lahko ogledate v več krajših videih na strani Bostonske otroške bolnišnice.
1. avg. 2007
Zebrica in zdravljenje slepote
Ko so raziskovali vid pri zebricah, so znanstveniki opazili, da imajo te ribe nenavadno sposobnost, da lahko regenerirajo poškodovano mrežnico. Medtem, ko pri človeku poškodbe mrežnice povzročijo slepoto, pri zebricah pride do razvoja novih celic, ki so sposobne zaznavati svetlobo. Senzorji za svetlobo v očesu so v resnici posebej prilagojene živčne celice, za te pa vsaj pri človeku vemo, da se praktično ne delijo in da ne nastajajo nove. Ameriški raziskovalci pa so sedaj v očeh odkrili izvorne celice, ki so se sposobne razviti v senzorske celice za svetlobo in to tako pri ribah kot tudi pri človeku. Te bi lahko služile za zdravljenje različnih oblik slepote. Izhodišče predstavljajo Müllerjeve glia-celice, ki so jih uspeli diferencirati v vse različne tipe živčnih celic v mrežnici, preprosto pa jih je tudi gojiti v laboratoriju.
Prve poskuse so opravili na podganah z okvarjeno mrežnico, ki so jim vbrizgali v laboratoriju gojene lastne celice. Ugotovili so, da so se celice umestile v mrežnico in prevzele lastnosti okoliških nevronov. Predvidevajo, da bi v petih letih uspeli na podoben način izvesti zdravljenje tudi s človeškimi celicami. Računajo celo, da bi imeli izvorne celice (v resnici bi bilo bolj prav govoriti o prekurzorskih celicah) različnih tipov kar na zalogi in bi se odločili za prave celice na osnovi genotipiziranja. Na enak način bi sicer lahko popravljali okvarjeno mrežnico tudi s celicami, ki bi izhajale iz embrionalnih izvornih celic.
Novico povzemam po Reutersu, članek z rezultati pa bo izšel v avgustovski številki revije Stem Cells in bo imel naslov "Celice MIO-M1 in celične linije njim podobnih Müllerjevih glia-celic, ki izhajajo iz mrežnic odraslih ljudi, imajo značilnosti živčnih izvornih celic".
Prve poskuse so opravili na podganah z okvarjeno mrežnico, ki so jim vbrizgali v laboratoriju gojene lastne celice. Ugotovili so, da so se celice umestile v mrežnico in prevzele lastnosti okoliških nevronov. Predvidevajo, da bi v petih letih uspeli na podoben način izvesti zdravljenje tudi s človeškimi celicami. Računajo celo, da bi imeli izvorne celice (v resnici bi bilo bolj prav govoriti o prekurzorskih celicah) različnih tipov kar na zalogi in bi se odločili za prave celice na osnovi genotipiziranja. Na enak način bi sicer lahko popravljali okvarjeno mrežnico tudi s celicami, ki bi izhajale iz embrionalnih izvornih celic.
Novico povzemam po Reutersu, članek z rezultati pa bo izšel v avgustovski številki revije Stem Cells in bo imel naslov "Celice MIO-M1 in celične linije njim podobnih Müllerjevih glia-celic, ki izhajajo iz mrežnic odraslih ljudi, imajo značilnosti živčnih izvornih celic".
30. jul. 2007
Sestavljeno genetsko stikalo
Blogger Franc mi je pisal v soboto, da me 'izziva' k razlagi članka, ki je izšel dan pred tem v reviji Cell, ker naj bi ga jaz gotovo dobro obdelal. No, takega vabila (izziva) res nisem mogel zavrniti, čeprav že vnaprej povem, da je tema zapletena. Je sicer s področja sintezne biologije, natančneje s področja genetskih stikal; naslov članka je "Nastavljivo genetsko stikalo na osnovi interferenčne RNA in represorskih proteinov za uravnavane izražanja genov v sesalskih celicah". Če hočemo razumeti vsebino članka, je treba najprej razjasniti nekaj osnovnih pojmov za vse tiste, ki se z molekularnimi vidiki izražanja genov doslej še niste natančneje spoznali.
Genetsko stikalo ponazarja molekulski sistem, ki omogoča, da se izražanje nekega gena vključi ali izključi kot posledica točno določenega stanja v celici. Poenostavljeno gledano izražanje gena predstavlja proces prepisovanja gena (DNA) v mRNA, pri tem procesu pa sodeluje kot ključni encim RNA-polimeraza. Gre torej zato, da neki drugi proteini (v povezavi z ligandi in pogosto ob vezavi na zaporedja DNA) omogočajo RNA-polimerazi prepisovanje gena. Na stikala v osnovi gledamo tako kot pri preprostih stikalih za prižiganje in ugašanje luči. V naslovu pa omenjajo 'nastavljivo stikalo' - tega si lažje predstavljamo kot stikalo z gumbom, pri katerem lahko nastavimo, kako močno bo žarnica svetila.
Pri uravnavanju izražanja bakterijskih genov je v naravi najpogostejši način ta, da se nek protein, ki se imenuje represor, veže na DNA tik ob zaporedju, na katero bi se sicer vezala RNA-polimeraza. S tem fizično onemogoča, da bi se začela sinteza mRNA in gen se torej ne izraža. Šele takrat, ko se razmere v celici spremenijo in se na represorski protein veže nek ligand, se zaradi vezave liganda tridimenzionalna zgradba represorja spremeni do te mere, da se zmanjša moč njegove vezave na DNA. Zato se sprosti z DNA, RNA-polimeraza pa se lahko veže in začne se izražanje gena; nastala mRNA se bo prevajala v protein. To je klasičen pogled na uravnavanje izražanja pri prokariontih, ki je star že 50 let. Pri evkariontih je uravnavanje pogosto obrnjeno - represorje srečamo sorazmerno redko, zato pa so pogostejši aktivatorji, to so proteini, ki RNA-polimerazi olajšajo vezavo na tarčno zaporedje DNA. Šele v zadnjih 10 letih se je izkazalo, da obstaja še nek v osnovi drugačen mehanizem uravnavanja izražanja, pri čemer imajo ključno vlogo zelo kratke molekule RNA, ki se vežejo na mRNA (pri klasičnem načinu se proteini vežejo na DNA) - govorimo o RNA-interferenci.
O interferenčni RNA so tudi nestrokovnjaki slišali par stavkov ob podelitvi lanskih Nobelovih nagrad. Za medicino sta jo dobila dva molekularna biologa, ki sta bolj ali manj naključno odkrila, da tak način uravnavanja res obstaja in ga nato tudi natančneje opisala. V molekularni genetiki gre gotovo za eno od najpomembnejših odkritij v zadnjih 20 letih, znano pa je tudi pod imenom 'utišanje genov, ki ga posreduje dvoverižna RNA'. Proces brez odvečnih poenostavitev predstavlja animacija na straneh revije Nature Reviews. Na kratko povedano gre za to, da v celicah nastane dvoverižna RNA, ki se ob delovanju encimov razcepi na ~25 nukleotidov dolge fragmente. Tista veriga fragmenta, ki ima zaporedje komplementarno mRNA, se veže na mRNA in sproži proces razgradnje mRNA, tako da se protein ne more sintetizirati. V tem primeru torej kratka RNA preprečuje izražanje gena na stopnji med mRNA in prevajanjem v protein, medtem ko pri klasičnem načinu uravnavanja uravnavanje poteka na stopnji med DNA in sintezo mRNA.
Rezultati, objavljeni v članku
Omenil sem že, da je članek s področja sintezne biologije, kar nakazuje, da je šlo za uvedbo novih načinov uravnavanja v celice. Delali so z gojenimi celicami kitajskega hrčka in s človeškimi celicami, kot tarčni gen pa so vzeli protein EGFP, to je genetska različica zeleno fluorescirajočega proteina, ki sicer izhaja iz neke pacifiške meduze. Celice so pripravili tako, da so v osnovi proizvajale EGFP in so torej prod fluorescenčnim mikroskopom žarele zeleno, če pa so uvedli učinkovit mehanizem utišanja, pa zelene fluorescence niso več zaznali. Kasneje so učinkovitost utišanja preizkusili še z nekaterimi drugimi geni in ugotovili, da je ta več kot 99-odstotna. Tako močan nadzor nad izražanjem genov je pomemben pri pripravi genskih konstruktov, ki jih uporabljamo pri raziskavah, saj moramo biti prepričani, da je nek učinek, ki ga spremljamo, res posledica izražanja točno določenega gena. Če ne moremo zagotoviti popolne odsotnosti nekega genskega produkta, lahko dobimo napačne rezultate.
Avtorji članka so pripravili sestavljeni konstrukt, ki so ga imenovali genetsko omrežje, gre pa za povezavo genetskih elementov, ki se medsebojno uravnavajo. Posamezne stopnje v sestavljanju 'omrežja' so predhodno preizkusili in dokazali, da delujejo. Izhodišče je dobro znani sistem uravnavanja laktoznega operona pri bakterijah, pri katerem se represorski protein (LacI) veže na nukleotidno zaporedje lacO v bližini mesta vezave RNA-polimeraze. Že pred precej leti so vedeli, da ta sistem dovolj dobro deluje tudi v genetsko spremenjenih sesalskih celicah. Represor se je izražal neprestano in je preprečeval, da bi se sintetizirali dve drugi mRNA: zapis za tetraciklinski represor (TetR) in zapis za EGFP, ki sta bila vstavljena v istem konstruktu navzgor in navzdol od zapisa za LacI. Ker se TetR ni sintetiziral, je bilo neovirano izražanje kratke interferenčne RNA, ki se je vezala na del 'gena' za EGFP in s tem dodatno preprečevala razvoj zelene fluorescence. Po dodatku liganda (izopropil-tiogalaktopiranozida, IPTG), ki deluje kot induktor, se je stikalo vključilo. Represor se ni več mogel vezati na tarčna mesta, zato se je začela sinteza tetraciklinskega represorja, ta pa se je vezal na mesta (tetO) pred zapisom za interferenčno RNA, zato se iRNA ni vezala na mRNA za EGFP, hkrati pa laktozni represor ni več preprečeval sinteze mRNA za EGFP in celice so začele fluorescirati.
Z meritvami so dokazali, da je bila raven izražanja EGFP sorazmerna koncentraciji induktorja (IPTG) in so zato sistem uravnavanja imenovali 'nastavljiv': več ko so dodali IPTG (razpon testiranih koncentracij je bil od 250 pM do 1 mM), močneje so celice fluorescirale.
Uvedba novega načina uravnavanja izražanja v sesalske celice ima kljub nekaterim prepričljivim dobrim stranem po mojem mnenju tudi vsaj dve pomanjkljivosti. Nastavljivost je zelo groba: v poskusih niso uporabili nobene take koncentracije IPTG, da bi bila raven izražanja EGFP med 20 % in 70 %, hkrati pa je odziv celic sorazmerno počasen. Od trenutka, ko celicam dodajo IPTG, do maksimalnega odgovora (raven EGFP) traja 2 dneva, po odvzemu IPTG pa do ničelne ravni EGFP v celicah traja tri dni.
Da je uvedeno genetsko stikalo zelo učinkovito in da je uporabno za raziskave celičnih procesov, so dokazali s tem, da so na primer namesto zapisa za EGFP v konstrukt vstavili zapis za alfa verigo difterijskega toksina (ki, če se izraža, celico ubije) ali zapis za protein Bax, ki sproži programirano celično smrt. Brez induktorja so celice z zapisom za toksin gojili 4 tedne brez vidnega učinka na njihovo rast in obliko, po dodatku induktorja pa se je njihova morfologija spremenila in so odmrle. Pri konstruktu z zapisom za Bax pa so ugotovili, da je bilo preživetje odvisno od ravni izražanja.
Genetsko stikalo ponazarja molekulski sistem, ki omogoča, da se izražanje nekega gena vključi ali izključi kot posledica točno določenega stanja v celici. Poenostavljeno gledano izražanje gena predstavlja proces prepisovanja gena (DNA) v mRNA, pri tem procesu pa sodeluje kot ključni encim RNA-polimeraza. Gre torej zato, da neki drugi proteini (v povezavi z ligandi in pogosto ob vezavi na zaporedja DNA) omogočajo RNA-polimerazi prepisovanje gena. Na stikala v osnovi gledamo tako kot pri preprostih stikalih za prižiganje in ugašanje luči. V naslovu pa omenjajo 'nastavljivo stikalo' - tega si lažje predstavljamo kot stikalo z gumbom, pri katerem lahko nastavimo, kako močno bo žarnica svetila.
Pri uravnavanju izražanja bakterijskih genov je v naravi najpogostejši način ta, da se nek protein, ki se imenuje represor, veže na DNA tik ob zaporedju, na katero bi se sicer vezala RNA-polimeraza. S tem fizično onemogoča, da bi se začela sinteza mRNA in gen se torej ne izraža. Šele takrat, ko se razmere v celici spremenijo in se na represorski protein veže nek ligand, se zaradi vezave liganda tridimenzionalna zgradba represorja spremeni do te mere, da se zmanjša moč njegove vezave na DNA. Zato se sprosti z DNA, RNA-polimeraza pa se lahko veže in začne se izražanje gena; nastala mRNA se bo prevajala v protein. To je klasičen pogled na uravnavanje izražanja pri prokariontih, ki je star že 50 let. Pri evkariontih je uravnavanje pogosto obrnjeno - represorje srečamo sorazmerno redko, zato pa so pogostejši aktivatorji, to so proteini, ki RNA-polimerazi olajšajo vezavo na tarčno zaporedje DNA. Šele v zadnjih 10 letih se je izkazalo, da obstaja še nek v osnovi drugačen mehanizem uravnavanja izražanja, pri čemer imajo ključno vlogo zelo kratke molekule RNA, ki se vežejo na mRNA (pri klasičnem načinu se proteini vežejo na DNA) - govorimo o RNA-interferenci.
O interferenčni RNA so tudi nestrokovnjaki slišali par stavkov ob podelitvi lanskih Nobelovih nagrad. Za medicino sta jo dobila dva molekularna biologa, ki sta bolj ali manj naključno odkrila, da tak način uravnavanja res obstaja in ga nato tudi natančneje opisala. V molekularni genetiki gre gotovo za eno od najpomembnejših odkritij v zadnjih 20 letih, znano pa je tudi pod imenom 'utišanje genov, ki ga posreduje dvoverižna RNA'. Proces brez odvečnih poenostavitev predstavlja animacija na straneh revije Nature Reviews. Na kratko povedano gre za to, da v celicah nastane dvoverižna RNA, ki se ob delovanju encimov razcepi na ~25 nukleotidov dolge fragmente. Tista veriga fragmenta, ki ima zaporedje komplementarno mRNA, se veže na mRNA in sproži proces razgradnje mRNA, tako da se protein ne more sintetizirati. V tem primeru torej kratka RNA preprečuje izražanje gena na stopnji med mRNA in prevajanjem v protein, medtem ko pri klasičnem načinu uravnavanja uravnavanje poteka na stopnji med DNA in sintezo mRNA.
Rezultati, objavljeni v članku
Omenil sem že, da je članek s področja sintezne biologije, kar nakazuje, da je šlo za uvedbo novih načinov uravnavanja v celice. Delali so z gojenimi celicami kitajskega hrčka in s človeškimi celicami, kot tarčni gen pa so vzeli protein EGFP, to je genetska različica zeleno fluorescirajočega proteina, ki sicer izhaja iz neke pacifiške meduze. Celice so pripravili tako, da so v osnovi proizvajale EGFP in so torej prod fluorescenčnim mikroskopom žarele zeleno, če pa so uvedli učinkovit mehanizem utišanja, pa zelene fluorescence niso več zaznali. Kasneje so učinkovitost utišanja preizkusili še z nekaterimi drugimi geni in ugotovili, da je ta več kot 99-odstotna. Tako močan nadzor nad izražanjem genov je pomemben pri pripravi genskih konstruktov, ki jih uporabljamo pri raziskavah, saj moramo biti prepričani, da je nek učinek, ki ga spremljamo, res posledica izražanja točno določenega gena. Če ne moremo zagotoviti popolne odsotnosti nekega genskega produkta, lahko dobimo napačne rezultate.
Avtorji članka so pripravili sestavljeni konstrukt, ki so ga imenovali genetsko omrežje, gre pa za povezavo genetskih elementov, ki se medsebojno uravnavajo. Posamezne stopnje v sestavljanju 'omrežja' so predhodno preizkusili in dokazali, da delujejo. Izhodišče je dobro znani sistem uravnavanja laktoznega operona pri bakterijah, pri katerem se represorski protein (LacI) veže na nukleotidno zaporedje lacO v bližini mesta vezave RNA-polimeraze. Že pred precej leti so vedeli, da ta sistem dovolj dobro deluje tudi v genetsko spremenjenih sesalskih celicah. Represor se je izražal neprestano in je preprečeval, da bi se sintetizirali dve drugi mRNA: zapis za tetraciklinski represor (TetR) in zapis za EGFP, ki sta bila vstavljena v istem konstruktu navzgor in navzdol od zapisa za LacI. Ker se TetR ni sintetiziral, je bilo neovirano izražanje kratke interferenčne RNA, ki se je vezala na del 'gena' za EGFP in s tem dodatno preprečevala razvoj zelene fluorescence. Po dodatku liganda (izopropil-tiogalaktopiranozida, IPTG), ki deluje kot induktor, se je stikalo vključilo. Represor se ni več mogel vezati na tarčna mesta, zato se je začela sinteza tetraciklinskega represorja, ta pa se je vezal na mesta (tetO) pred zapisom za interferenčno RNA, zato se iRNA ni vezala na mRNA za EGFP, hkrati pa laktozni represor ni več preprečeval sinteze mRNA za EGFP in celice so začele fluorescirati.
Z meritvami so dokazali, da je bila raven izražanja EGFP sorazmerna koncentraciji induktorja (IPTG) in so zato sistem uravnavanja imenovali 'nastavljiv': več ko so dodali IPTG (razpon testiranih koncentracij je bil od 250 pM do 1 mM), močneje so celice fluorescirale.
Uvedba novega načina uravnavanja izražanja v sesalske celice ima kljub nekaterim prepričljivim dobrim stranem po mojem mnenju tudi vsaj dve pomanjkljivosti. Nastavljivost je zelo groba: v poskusih niso uporabili nobene take koncentracije IPTG, da bi bila raven izražanja EGFP med 20 % in 70 %, hkrati pa je odziv celic sorazmerno počasen. Od trenutka, ko celicam dodajo IPTG, do maksimalnega odgovora (raven EGFP) traja 2 dneva, po odvzemu IPTG pa do ničelne ravni EGFP v celicah traja tri dni.
Da je uvedeno genetsko stikalo zelo učinkovito in da je uporabno za raziskave celičnih procesov, so dokazali s tem, da so na primer namesto zapisa za EGFP v konstrukt vstavili zapis za alfa verigo difterijskega toksina (ki, če se izraža, celico ubije) ali zapis za protein Bax, ki sproži programirano celično smrt. Brez induktorja so celice z zapisom za toksin gojili 4 tedne brez vidnega učinka na njihovo rast in obliko, po dodatku induktorja pa se je njihova morfologija spremenila in so odmrle. Pri konstruktu z zapisom za Bax pa so ugotovili, da je bilo preživetje odvisno od ravni izražanja.
25. jul. 2007
Daniel E. Koshland Jr. (1920-2007)
Predvčerajšnjim je za posledicami kapi umrl ugledni biokemik Dan Koshland. Dobrih 10 let je bil urednik revije Science, pomemben pa je tudi njegov prispevek k razvoju ved o življenju na univerzi Berkeley v Kaliforniji. Kot biokemik se je v svojih raziskovalnih letih ukvarjal z encimatiko in tako že ob koncu petdesetih let razvil model 'induciranega prileganja' substrata in encima. Dotlej je namreč večina biokemikov to interakcijo razumela po principu 'ključa in ključavnice'. Izkazalo pa se je, da sta tako substrat kot žep aktivnega mesta na encimu fleksibilna interakcijska partnerja in njegova teorija v osnovi še vedno velja.
Dan Koshland je diplomiral iz kemije leta 1941 in je kmalu zatem sodeloval pri projektu Manhattan (razvoj atomske bombe). Doktoriral je iz organske kemije leta 1949. Po skoraj dveh desetletjih dela na področju encimatike je v 70-tih raziskoval kemotaksijo pri bakterijah in ob tem preučeval lastnosti receptorskih molekul in prenos signalov s površine celice v notranjost. Nazadnje se je ukvarjal še z bioenergetiko (proizvodnja metana s pomočjo cianobakterij). Bil je profesor molekularne in celične biologije, član Ameriške akademije znanosti, bil je predsednih Ameriškega društva bioloških kemikov, prejemnik več častnih doktoratov znanosti in drugih znanstvenih priznanj.
Povzeto po novici univerze Berkeley.
Dan Koshland je diplomiral iz kemije leta 1941 in je kmalu zatem sodeloval pri projektu Manhattan (razvoj atomske bombe). Doktoriral je iz organske kemije leta 1949. Po skoraj dveh desetletjih dela na področju encimatike je v 70-tih raziskoval kemotaksijo pri bakterijah in ob tem preučeval lastnosti receptorskih molekul in prenos signalov s površine celice v notranjost. Nazadnje se je ukvarjal še z bioenergetiko (proizvodnja metana s pomočjo cianobakterij). Bil je profesor molekularne in celične biologije, član Ameriške akademije znanosti, bil je predsednih Ameriškega društva bioloških kemikov, prejemnik več častnih doktoratov znanosti in drugih znanstvenih priznanj.
Povzeto po novici univerze Berkeley.
Naročite se na:
Objave (Atom)