Sestavljeno genetsko stikalo

Blogger Franc mi je pisal v soboto, da me 'izziva' k razlagi članka, ki je izšel dan pred tem v reviji Cell, ker naj bi ga jaz gotovo dobro obdelal. No, takega vabila (izziva) res nisem mogel zavrniti, čeprav že vnaprej povem, da je tema zapletena. Je sicer s področja sintezne biologije, natančneje s področja genetskih stikal; naslov članka je "Nastavljivo genetsko stikalo na osnovi interferenčne RNA in represorskih proteinov za uravnavane izražanja genov v sesalskih celicah". Če hočemo razumeti vsebino članka, je treba najprej razjasniti nekaj osnovnih pojmov za vse tiste, ki se z molekularnimi vidiki izražanja genov doslej še niste natančneje spoznali.

Genetsko stikalo ponazarja molekulski sistem, ki omogoča, da se izražanje nekega gena vključi ali izključi kot posledica točno določenega stanja v celici. Poenostavljeno gledano izražanje gena predstavlja proces prepisovanja gena (DNA) v mRNA, pri tem procesu pa sodeluje kot ključni encim RNA-polimeraza. Gre torej zato, da neki drugi proteini (v povezavi z ligandi in pogosto ob vezavi na zaporedja DNA) omogočajo RNA-polimerazi prepisovanje gena. Na stikala v osnovi gledamo tako kot pri preprostih stikalih za prižiganje in ugašanje luči. V naslovu pa omenjajo 'nastavljivo stikalo' - tega si lažje predstavljamo kot stikalo z gumbom, pri katerem lahko nastavimo, kako močno bo žarnica svetila.

Pri uravnavanju izražanja bakterijskih genov je v naravi najpogostejši način ta, da se nek protein, ki se imenuje represor, veže na DNA tik ob zaporedju, na katero bi se sicer vezala RNA-polimeraza. S tem fizično onemogoča, da bi se začela sinteza mRNA in gen se torej ne izraža. Šele takrat, ko se razmere v celici spremenijo in se na represorski protein veže nek ligand, se zaradi vezave liganda tridimenzionalna zgradba represorja spremeni do te mere, da se zmanjša moč njegove vezave na DNA. Zato se sprosti z DNA, RNA-polimeraza pa se lahko veže in začne se izražanje gena; nastala mRNA se bo prevajala v protein. To je klasičen pogled na uravnavanje izražanja pri prokariontih, ki je star že 50 let. Pri evkariontih je uravnavanje pogosto obrnjeno - represorje srečamo sorazmerno redko, zato pa so pogostejši aktivatorji, to so proteini, ki RNA-polimerazi olajšajo vezavo na tarčno zaporedje DNA. Šele v zadnjih 10 letih se je izkazalo, da obstaja še nek v osnovi drugačen mehanizem uravnavanja izražanja, pri čemer imajo ključno vlogo zelo kratke molekule RNA, ki se vežejo na mRNA (pri klasičnem načinu se proteini vežejo na DNA) - govorimo o RNA-interferenci.

O interferenčni RNA so tudi nestrokovnjaki slišali par stavkov ob podelitvi lanskih Nobelovih nagrad. Za medicino sta jo dobila dva molekularna biologa, ki sta bolj ali manj naključno odkrila, da tak način uravnavanja res obstaja in ga nato tudi natančneje opisala. V molekularni genetiki gre gotovo za eno od najpomembnejših odkritij v zadnjih 20 letih, znano pa je tudi pod imenom 'utišanje genov, ki ga posreduje dvoverižna RNA'. Proces brez odvečnih poenostavitev predstavlja animacija na straneh revije Nature Reviews. Na kratko povedano gre za to, da v celicah nastane dvoverižna RNA, ki se ob delovanju encimov razcepi na ~25 nukleotidov dolge fragmente. Tista veriga fragmenta, ki ima zaporedje komplementarno mRNA, se veže na mRNA in sproži proces razgradnje mRNA, tako da se protein ne more sintetizirati. V tem primeru torej kratka RNA preprečuje izražanje gena na stopnji med mRNA in prevajanjem v protein, medtem ko pri klasičnem načinu uravnavanja uravnavanje poteka na stopnji med DNA in sintezo mRNA.

Rezultati, objavljeni v članku
Omenil sem že, da je članek s področja sintezne biologije, kar nakazuje, da je šlo za uvedbo novih načinov uravnavanja v celice. Delali so z gojenimi celicami kitajskega hrčka in s človeškimi celicami, kot tarčni gen pa so vzeli protein EGFP, to je genetska različica zeleno fluorescirajočega proteina, ki sicer izhaja iz neke pacifiške meduze. Celice so pripravili tako, da so v osnovi proizvajale EGFP in so torej prod fluorescenčnim mikroskopom žarele zeleno, če pa so uvedli učinkovit mehanizem utišanja, pa zelene fluorescence niso več zaznali. Kasneje so učinkovitost utišanja preizkusili še z nekaterimi drugimi geni in ugotovili, da je ta več kot 99-odstotna. Tako močan nadzor nad izražanjem genov je pomemben pri pripravi genskih konstruktov, ki jih uporabljamo pri raziskavah, saj moramo biti prepričani, da je nek učinek, ki ga spremljamo, res posledica izražanja točno določenega gena. Če ne moremo zagotoviti popolne odsotnosti nekega genskega produkta, lahko dobimo napačne rezultate.

Avtorji članka so pripravili sestavljeni konstrukt, ki so ga imenovali genetsko omrežje, gre pa za povezavo genetskih elementov, ki se medsebojno uravnavajo. Posamezne stopnje v sestavljanju 'omrežja' so predhodno preizkusili in dokazali, da delujejo. Izhodišče je dobro znani sistem uravnavanja laktoznega operona pri bakterijah, pri katerem se represorski protein (LacI) veže na nukleotidno zaporedje lacO v bližini mesta vezave RNA-polimeraze. Že pred precej leti so vedeli, da ta sistem dovolj dobro deluje tudi v genetsko spremenjenih sesalskih celicah. Represor se je izražal neprestano in je preprečeval, da bi se sintetizirali dve drugi mRNA: zapis za tetraciklinski represor (TetR) in zapis za EGFP, ki sta bila vstavljena v istem konstruktu navzgor in navzdol od zapisa za LacI. Ker se TetR ni sintetiziral, je bilo neovirano izražanje kratke interferenčne RNA, ki se je vezala na del 'gena' za EGFP in s tem dodatno preprečevala razvoj zelene fluorescence. Po dodatku liganda (izopropil-tiogalaktopiranozida, IPTG), ki deluje kot induktor, se je stikalo vključilo. Represor se ni več mogel vezati na tarčna mesta, zato se je začela sinteza tetraciklinskega represorja, ta pa se je vezal na mesta (tetO) pred zapisom za interferenčno RNA, zato se iRNA ni vezala na mRNA za EGFP, hkrati pa laktozni represor ni več preprečeval sinteze mRNA za EGFP in celice so začele fluorescirati.



Z meritvami so dokazali, da je bila raven izražanja EGFP sorazmerna koncentraciji induktorja (IPTG) in so zato sistem uravnavanja imenovali 'nastavljiv': več ko so dodali IPTG (razpon testiranih koncentracij je bil od 250 pM do 1 mM), močneje so celice fluorescirale.

Uvedba novega načina uravnavanja izražanja v sesalske celice ima kljub nekaterim prepričljivim dobrim stranem po mojem mnenju tudi vsaj dve pomanjkljivosti. Nastavljivost je zelo groba: v poskusih niso uporabili nobene take koncentracije IPTG, da bi bila raven izražanja EGFP med 20 % in 70 %, hkrati pa je odziv celic sorazmerno počasen. Od trenutka, ko celicam dodajo IPTG, do maksimalnega odgovora (raven EGFP) traja 2 dneva, po odvzemu IPTG pa do ničelne ravni EGFP v celicah traja tri dni.

Da je uvedeno genetsko stikalo zelo učinkovito in da je uporabno za raziskave celičnih procesov, so dokazali s tem, da so na primer namesto zapisa za EGFP v konstrukt vstavili zapis za alfa verigo difterijskega toksina (ki, če se izraža, celico ubije) ali zapis za protein Bax, ki sproži programirano celično smrt. Brez induktorja so celice z zapisom za toksin gojili 4 tedne brez vidnega učinka na njihovo rast in obliko, po dodatku induktorja pa se je njihova morfologija spremenila in so odmrle. Pri konstruktu z zapisom za Bax pa so ugotovili, da je bilo preživetje odvisno od ravni izražanja.