V reviji Nanotechnology bo 31. januarja izšel članek (trenutno je prosto dostopen v celoti) o nanotehnološkem načinu detekcije posameznih molekul mRNA v celici.
Doslej se je zdelo, da je že mogoče zaznati vsako molekulo mRNA v nekem vzorcu, vendar če bi postopek pogledali natančno, temu ne bi mogli v celoti pritrditi. Postopek je naslednji: iz majhnega vzorca tkiva izoliramo mRNA, jo z encimom reverzno transkriptazo prepišemo v DNA in s pomočjo biočipov identificiramo, katere mRNA so bile v vzorcu. Vendar se na tak način ne da enostavno zaznati molekul, ki v celicah nastopajo v majhnem številu kopij, saj so se v postopku lahko izgubile. Računajo, da je v povprečni človeški celici 300.000 molekul mRNA in to okrog 30.000 različnih s povprečno dolžino 1500 nukleotidov. Jasno je torej, da nekatere mRNA najdemo le v par kopijah, kar pa ne pomeni, da gre za nepomembne transkripte, saj nekateri regulatorni proteini lahko opravijo pomembno funkcijo tudi ob majhnem številu proteinskih molekul.
Z analizo molekul mRNA lahko pripravimo profil izražanja genov, ki je pomemben podatek o fiziološkem stanju celice. Tovrstni profili so lahko pomembni tudi za diagnostiko, izbor in preverjanje uspešnosti zdravljenja. Za rutinsko analizo je pomembno, da je profil mogoče izdelati iz majhnega števila celic in da je mogoče zaznati tudi redke transkripte (torej molekule mRNA, ki so prisotne v manj kot 10 kopijah v celici). S tem, ko bi lahko analizirali posamezne celice, ne pa heterogenih vzorcev iz biopsije, bi bil vpogled v transkriptom bolj natančen, ker ne bi bilo šuma signalov iz celic, ki nas v analizi ne zanimajo.
Novi nanotehnološki način identifikacije transkriptov uporablja specifičnost rezanja DNA z restrikcijskimi encimi, končna detekcija pa poteka s pomočjo mikroskopa na atomsko silo (AFM). V članku opisujejo sicer le metodo, ki je niso izvedli z mRNA kot osnovo, pač pa z DNA z znanimi lastnostmi. [Lahko pa si je predstavljati, da bi enako naredili tudi z mRNA, ki bi jo najprej obratno prevedli v cDNA.] Linearno DNA so položili in fiksirali na inerten nosilec in jo rezali z restiktazami, ki prepoznajo zaporedje 4 točno določenih baznih parov. Po rezanju so v verigi nastale zareze; vzorec DNA so sprali in posušili z dušikom, nato pa določili dolžine fragmentov pritrjene DNA (v nm oziroma baznih parih).
Ključno je, da restriktaze, ki prepoznajo 4 bp, v povprečju režejo na 256 bp, kar pomeni, da bi večino mRNA (oziroma cDNA) lahko razrezali z encimi na način, da bi razpadla na zadostno število točno določenih dolžin fragmentov. To bi bila neke vrste črtna koda transkripta in dobra osnova za identifikacijo.
Kratko novico o tem dosežku najdete tudi na strani Science Direct.
Ni komentarjev:
Objavite komentar